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신나는 탐구생활

공초점 레이저 주사 현미경, Confocal Laser Scanning Microscopy(CLSM)

배고픈 돈까스 2019. 8. 5. 00:22

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ZEISS CLSM

  공초점 레이저 주사 현미경은 초점을 공유하는 공초점 현미경에서 더 나아가 레이저를 광원으로 사용하여 초점을 공유하는 형식으로 관찰하는 현미경이다. 레이저는 시료의 내부까지 침투할 수 있어서 3차원적인 영상으로도 구현할 수 있다. 초점이 정확하게 맞는 검출 조리개로 관찰하기 때문에 좋은 이미지를 얻을 수 있다. 과연 좋은 이미지란 무엇일까? 좋은 이미지는 signal은 많고 noise는 작은 이미지이다. 따라서, 주로 공초점 레이저 주사 현미경에서 signal, noise를 어떻게 조절하는지를 이야기할 것이다.

CLSM 원리

기존의 현미경에서는 Light Source에서 나온 빛이 Dichroic Mirror에서 반사되어 Sample을 통과한 후에 Detector로 들어오는 형식이었다. 반사된 빛이 바로 Detector로 들어오기 때문에 시료로 붙어 굴절된 빛 또한 모두 Detector로 들어와서 관찰하려는 상이 뿌옇게 보일 수 있다. 상이 뿌옇게 바뀌는 현상을 공초점 레이저 주사 현미경에서는 Pinhole이라는 검출 조리개를 이용한다. 조리개를 이용해 시료의 원치 않는 부분에서 굴절된 빛을 걸러내어 선명한 상을 얻어내게 되는 것이다. Pinhole을 작게 한다면 굴절된 빛을 걸러낼 수 있다. Pinhole이 작아지면 resolution이 증가하여 선명한 상을 얻을 수 있지만, Detector로 들어오는 빛의 양이 작아지게 되어 어두운 상을 얻게 된다. 이 문제를 해결하기 위해 광량을 증가시키면 밝은 상을 얻을 수 있지만 자칫 시료가 파괴될 수 있다. 따라서 적절한 크기의 Pinhole을 선택하는 것이 중요하다. ( 1이 Pinhole diameter의 기준이다. )

 

공초점 레이저 주사 현미경에서는 크게 “Fastest mode”, “Best Signal mode” 기능을 활용하여 관찰할 수 있다. “Fastest mode”를 통해서 관측하게 되면 cross talk라는 문제가 발생한다. cross talk는  두 종류의 다이에서 흡수하는 파장 영역대가 겹쳐져서 나타나는 현상으로 specimen을 2개 이상의 Ditector로 관측했을 때, 빨간색과 초록색이 합쳐져 노란색으로 관측되는 현상이다. “Fastest mode”를 “Best Signal mode”로 변경해준다면, 각각 서로 다른 파장을 이용하여 표본을 관측할 수 있다.

 

“Best Signal mode”에서 서로 다른 파장을 사용하여 관측하는 방법에는 3가지 방법이 있다. 3가지 방법에 있어서 중요시해야 하는 것은 가장 빠른 시간 내에 좋은 이미지를 얻는 것이다.

3가지 방법이다.

<1>, <2>, <3> 순서대로 <1> 이 가장 느린 방법이고 <3> 이 가장 빠른 방법이다. <1>의 방법에서는 2개의 채널을 이용하여 관찰한다. 관찰하면서 하드웨어의 설정이 바뀌게 되어 가장 느리다. <2>의 방법에서는 Green을 Red가 엄청 미세한 차이를 두고 따라가는 형식으로 바뀐다. Green을 Red가 따라가면서 하드웨어 설정이 바뀌지 않기 때문에 <1>의 방법보다는 빠르게 된다. <3>의 방법에서는 <2>에서 한 방향으로 진행하는 방식을 양방향(Bidirectional)으로 바꾸어 더 효율적으로 관찰하는 방법으로 바꿔준다.

 

공초점 레이저 주사 현미경을 어디에서 사용할 수 있을까? 

첫째로, 공초점 레이저 주사 현미경에서는 tile scan이라는 기능이 있다. 기존에는 표본을 찍을 때 특정 부분을 자세히 보고 싶다면 확대해서 관측해야 했지만, tile scan은 한 장씩 찍어 여러 장을 합쳐준다. 즉, tile scan을 통해 확대하지 않아도 여러 장을 하나로 합친 선명한 사진을 얻을 수 있게 된다. 하지만 제대로 관찰이 안될 수도 있기 때문에 tile scan에서 curver glass를 사용할 때는 한쪽으로 너무 쏠리지 않도록 해야 한다고 한다. 

두 번째로, 공초점 레이저 주사 현미경에는 FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)이라는 관찰 기술이 있다. 세기가 센 laser를 이용하여 세포의 소기관에 laser를 쪼여 recovery가 일어나는 과정을 관찰한다. 예를 들어서 protein이 어떻게 유입되는지 관찰할 수 있다. 다른 형광 현미경에서도 가능하지만 공초점 레이저 주사 현미경에서는 pixel 단위로 측정하기 때문에 더욱더 쉽다고 한다. 이 밖에도 3D Image로 재구성하는 기능, 온도에 따라서 Pinhole을 조절해주는 기능 등의 여러 가지 기능이 있다.

 

출처 : http://www.emu.uct.ac.za/lecture-5-confocal-laser-scanning-microscopy [Electron Microscope Unit]

         ZEISS 공초점 주사 현미경 사진



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